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　　液相色譜-質譜聯用儀（LC/MS）是檢測mRNA疫苗和寡核苷酸的一個重要手段，其中一個典型的工作是通過質譜圖中一系列多電荷離子的質荷比（m/z）和電荷數（z），來計算分子的平均分子量。

　　通常這一任務是在高分辨質譜上完成，但在某些情況下，其高昂的成本或較高的技術門檻，對一些實驗室來說是一種挑戰。

　　低分辨的LC/MSD四極桿質譜儀的采購成本和使用成本更低，通過在系統中增加MassWorks質譜校正軟件，也可以讓四極桿LC/MS像高分辨質譜那樣對多電荷的大分子（如蛋白、寡核苷酸、聚合物等）進行精確質量分子量的測定。

　　實驗

　　儀器：安捷倫Infinity II 1290 -6135C LC/MSD XT

　　數據分析：Cerno MassWorks軟件

　　質譜條件：全掃描 700-3000 m/z，數據采集模式為Profile，采樣閾值設置為零（Threshold = 0）。

　　樣品：寡核苷酸標準品，信息如表1。

　　表1：寡核苷酸標準品信息

　　1. 質譜數據校正

　　在MassWorks 軟件中，打開Agilent LC/MS調諧液的質譜數據（見圖1），選取目標離子用于質譜圖的精確質量和峰型校正。

　　圖1：在MassWokrs選取LC/MS調諧液的標準離子用于質譜校正

　　標樣校正結果（見圖2）表明，用于校正的8個標準離子的絕對質量偏差均小于1.6mDa，相對質量誤差小于2.6 ppm，譜圖準確度（Spectral Accuracy）大于95%，校正結果表現很好，可以用于后續的樣品數據的分析。

　　圖2：質譜校正結果

　　2. 結果與討論

　　寡核苷酸標準品在安捷倫OpenLab CDS中的原始質譜圖見圖3，每個質譜峰的m/z僅能測定至小數點后1位（0.1）。

　　圖3：OpenLab CDS的原始質譜圖

　　經MassWorks軟件校正處理后的寡核苷酸質譜圖如圖4所示，每個質譜峰的m/z都被測定至小數點4位（0.0001）。

　　圖4：經MassWorks軟件校準后的精確質量質譜圖

　　3. 手動質譜解卷積//分子量計算

　　分子量（MW）的計算是通過如圖5所示的一系列離子的電荷數（z）及m/z，并參考圖6的公式來進行。其中m1和m2是兩個相鄰質譜峰的m/z值，而X是加合物的質量。當比較該寡核苷酸原始質譜圖和精確質量質譜圖的結果時，發現經MassWorks得出的平均MW的不確定性顯著降低，并且非常接近理論的MW。

　　圖5：分子量MW的計算結果（左：用OpenLab CDS中的“名義質量”計算的分子量；右：用MassWorks中的精確質量計算的分子量）

　　圖6：電荷數Z和分子量MW的計算公式

　　4. 未知峰的分子量測定

　　對未知峰進行了類似的計算，同時檢查了較小的肩峰。共檢測到了3種不同的離子并計算了它們的相對濃度。該未知峰主要為寡核苷酸的neutral形式，其含量為80.64%，其它兩種離子的MW分別偏移了+22.26 Da和+38.65 Da，表明是Na+和K+加合物，結果見圖7。

　　圖7：未知峰的分子量測定

　　5. 多電荷離子譜圖準確度模型（SAMMI）

　　由于寡核苷酸序列已知，我們可以在MassWorks軟件中用SAMMI工具進行進一步的確認分析，同時我們還可以對其它的加合物或修飾物進行確證分析。如在圖8的示例，SAMMI能夠分配并解釋全部的質譜峰，整體的譜圖準確度為86.3%，并且證實了寡核苷酸質譜圖中Na+和K+加合物的存在。

　　圖8：SAMMI分析寡核苷酸標樣的結果

　　6. 結論

　　1）在低分辨率的單四極桿LC/MSD系統上，通過MassWorks軟件的適當校正獲得了寡核苷酸的精確質量質譜圖。

　　2）通過手動的分子量計算，比較了使用定義質量和精確質量分別計算平均分子量的結果，結果表明MassWorks的精確質量譜圖極大地提高了分析可信度。

　　3）利用SAMMI工具進行的未知物分析和寡核苷酸標樣的分析均證實了Na+和K+加合物的存在，且譜圖準確性高。

　　關于MassWorks 軟件

　　MassWorks軟件是由 Cerno Bioscience 公司開發的一款革命性的MS數據定性分析軟件，能幫助我們在低分辨率的四極桿GC/MS、LC/MS直接測定化合物的精確質量，并通過獨有的譜圖準確度概念確定出準確的分子式。MassWorks軟件同樣適用于高分率質譜（TOF、Orbitrap）的定性分析。

　　關于綠綿科技

　　綠綿科技是Cerno Bioscience公司在中國區的總代理商，負責Cerno公司旗下的MassWorks、GC/ID 等產品市場推廣、銷售、售前/售后技術支持、應用支持。

　　若您想了解獲取 MassWorks 產品的更多信息或應用，歡迎致電綠綿科技！