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　　質譜的質量精度是衡量質譜定性能力的一個重要指標，當前常見的高分辨質譜系統（TOF、Orbitrap）的質量精度為通常在1-5ppm之間，但我們很難通過測定的精確質量數得到未知物的唯一分子式，特別是對于m/z > 400的化合物。

如圖1所示，即使質量精度達到FT-MS的0.1 ppm以內，隨著分子量的增大，分子式的可能性越來越多。因此，僅靠質譜的高質量精度，往往并不能確定一個唯一的分子式，尤其是當要考慮到更多的元素種類時。

圖1：不同質量精度下的元素組成個數

（數據來源：Tobias Kind and Oliver Fiehn, BMC Bioinformatics 2006, 7:234）

質譜上測定一個化合物時得到的信息不只是單同位素峰的精確質量，還包括了它的重同位素峰及其相對分布。Tobias Kind和Oliver Fiehn在2006年的文章中已經證明了同位素比例結合精確質量數在減少可能的元素組成方面比單純依靠更高的分辨率和質量精度更占優勢。在下文中，我們將在高分辨率(TOF或Orbitrap)和傳統的單或三重四極質譜系統上進行實驗，介紹和質量精度和同位素譜圖準確度（Spectral Accuracy）相結合對未知物分子式鑒定的作用。

　　四極桿質譜上的未知物的分子式測定

　　在MassWorks軟件中借助TrueCal?校正技術，可以將四極桿質譜的質量精度提高100倍以上，將質量精度從0.x提升至0.00x的質量精度。結合在校正過程獲得的無與倫比的譜圖準確度（Spectral Accuracy），通過CLIPS檢索分析，就可以在四極桿GC/MS或LC/MS上來獲得鑒定未知化合物的分子式的能力。我們對LC/MS測定的C25H23N2OS+進行了分析，MassWorks軟件測定的精確質量數m/z = 399.1448，圖2顯示CLIPS檢索分析的條件，設定可能元素組成為C、H、N、O、S，檢索的質量誤差為 ±20mDa。

圖2：CLIPS檢索條件

　　圖3顯示了CLIPS檢索分析的結果，列表中一共有126個可能的候選分子式。當我們用同位素的譜圖準確度（Spectral Accuracy）進行排序時，譜圖準確度≥98.5%的候選分子式只有5個，正確的分子式C25H23N2OS被準確地顯示在了列表中的第1位。

圖3：C25H23N2OS的CLIPS分子式檢索結果（按譜圖準確度從高至低排序）

正確分子式C25H23N2OS的譜圖準確度為99.1%，圖4（上）顯示了其理論譜圖和校正譜圖的對比，兩者完美重合。圖4（下）顯示了排名第1、5、6位分子式的理論譜圖的對比，可以看到，由于C原子個數的不同，在重同位素A+1處，存在明顯的豐度差異，譜圖準確度越高，分子式正確的可能越高。因此譜圖準確度是幫我們識別正確分子式的一個重要指標。

　　圖4：（上）校正譜圖與排序第一的分子式的理論同位素分布比較；（下）排序1、5、6位分子式的理論同位素分布比較

如果只考慮質量精度，我們需要達到多少的精度才能幫助我們去找到目標分子式呢？我們假設了理論的精確質量為實測值，重新進行了CLIPS分子式檢索，并將分子式的排序設定為按質量誤差排序，結果見圖5。在得到的119個待選結果中，至少需要質量精度優于1.5ppm才能在前5個候選分子式中找到正確的分子式。

　　圖5：C25H23N2OS的分子式檢索結果（按質量誤差從小到大排序）

　　高分辨質譜TOF的未知物的分子式測定

　　在MassWorks軟件中通過sCLIPS檢索分析，可以對TOF數據進行全面的峰形校正以獲得高的譜圖準確度。圖6顯示了C43H74NO15的質譜圖校正前后的對比。

圖6：化合物C43H74NO15的TOF數據校正前后的比較

圖7為sCLIPS檢索分析時設定的檢索參數，設定可能元素組成為C、H、N、O、S，檢索的質量誤差為 ±5ppm。

　　圖7：sCLIPS檢索條件

　　圖8顯示了sCLIPS檢索分析的結果，列表中一共有63個可能的候選分子式。當我們用同位素的譜圖準確度（Spectral Accuracy）進行排序時，分別只有3個或2個候選分子式的譜圖準確度≥98%或98.5%，正確的分子式C43H74NO15被準確地顯示在了列表中的第1位。

圖8：C43H74NO15的sCLIPS分子式檢索結果（按譜圖準確度從高至低排序）

　　正確分子式C43H74NO15的譜圖準確度為98.97%，圖9（上）顯示了其理論譜圖和校正譜圖的對比，兩者完美重合。圖9（下）顯示了排名第1、3、4位分子式的理論譜圖的對比，可以看出排序第4的分子式的同位素分布的誤差明顯大于前兩個分子式，因此在實際的驗證分析中，我們只需要考察前三個分子式。

圖9：（上）校正譜圖與排序第一的分子式的理論同位素分布比較；（下）排序1、3、4位分子式的理論同位素分布比較

　　既然通過譜圖準確度能幫我們準確地將分子式鎖定在前3位，那如果只考慮質量精度，我們的TOF需要達到多少的精度才能幫助我們去找到目標分子式呢？我們假設了理論的精確質量為實測值，重新進行了sCLIPS分子式檢索，并將分子式的排序設定為按質量誤差排序，結果見圖10。在得到的候選結果中，需要具有高于0.2ppm或0.02ppm的非常高的質量精度，才能分別在前3個或前2個候選元素中找到正確的元素組成。

圖10：C43H74NO15的分子式檢索結果（按質量誤差從小到大排序）

　　 結論 

　　1）四極桿質譜上：[20mDa質量精度+98.5%譜圖準確度精度]=1.5ppm

20mDa (50ppm @ 400Da)的質量誤差與98.5%的譜圖準確度相結合，通過TrueCal可以在大多數單、三重四極桿質譜系統上實現，等同于1.5ppm的質量精度的分子式鑒定效果，且正確的分子式排在前5位，這相當于TOF的未知物鑒定水平。

2）高分辨質譜上：[5ppm質量精度+98.0%譜圖準確度]=0.2ppm

5ppm的質量精度(@845Da)結合98.0%的譜圖準確度，可以在高分辨質譜系統上實現等同于0.2ppm質量精度的分子式鑒定效果，且正確的元素組成排在前3位。3）在未知物的鑒定分析中，無需過分地追求更優的質量精度，更好的質量精度意味著更高的硬件投入成本；而是應該考慮質量精度+譜圖準確度的組合，在現有的質譜系統上，通過譜圖準確度來提升質譜系統的未知物鑒定潛力。如四極桿質譜+MassWorks軟件來達到TOF的未知物定性效果。

關于MassWorks

　　軟件MassWorks軟件是由 Cerno Bioscience 公司開發的一款革命性的MS數據定性分析軟件，能幫助我們在低分辨率的四極桿GC/MS、LC/MS直接測定化合物的精確質量，并通過獨有的譜圖準確度概念確定出準確的分子式。MassWorks軟件同樣適用于高分率質譜（TOF、Orbitrap）的定性分析。

　　關于綠綿科技

綠綿科技是Cerno Bioscience公司在中國區的總代理商，負責Cerno公司旗下的MassWorks、GC/ID 等產品市場推廣、銷售、售前/售后技術支持、應用支持。若您想了解獲取 MassWorks 產品的更多信息或應用，歡迎致電綠綿科技！