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循環(huán)制備色譜法是一種有趣的可分離兩種緊密洗脫組分的技術(shù)，它通過(guò)增加色譜柱的長(zhǎng)度而實(shí)現(xiàn)峰的分離。當(dāng)其他優(yōu)化方法如降低流量或改變?nèi)軇┨荻纫廊徊荒芨淖兡繕?biāo)峰的分離效果時(shí)，它可以作為一種非常有效替代方法而發(fā)揮作用。

在之前的文章中（循環(huán)制備液相色譜 —— 解決未分離混合峰組的分離難題）我們介紹了一種循環(huán)制備色譜方案來(lái)解決共洗脫峰的分離，該方案采用了一根色譜柱，通過(guò)閉環(huán)循環(huán)的方式將峰組反復(fù)循環(huán)至色譜柱內(nèi)進(jìn)行分離，每次循環(huán)時(shí)，峰組都會(huì)經(jīng)過(guò)泵。

圖1：閉環(huán)循環(huán)制備色譜的原理

該閉環(huán)循環(huán)方式的優(yōu)點(diǎn)是溶劑消耗將很低，在峰被收集之前，不會(huì)產(chǎn)生新的溶劑消耗，僅靠管路內(nèi)部溶劑即可實(shí)現(xiàn)循環(huán)和分離。但它的主要缺點(diǎn)是系統(tǒng)的死體積較大，每次循環(huán)時(shí)，管線、泵頭或混合器都將增加死體積，這將導(dǎo)致組分在離開色譜柱后會(huì)有少量組分重新混合。因此，每循環(huán)一次都將顯著增加峰展寬。

圖2：閉環(huán)循環(huán)色譜法分離萊苞迪甙A和甜菊苷

今天我們將介紹一種改進(jìn)的循環(huán)制備方法，它的優(yōu)點(diǎn)是有更好的峰分離度。該方法將由兩個(gè)相同的色譜柱來(lái)實(shí)現(xiàn)循環(huán)分離。通過(guò)柱切換閥，從柱1上洗脫后的目標(biāo)峰被重新注入柱2，組分將不再經(jīng)過(guò)泵。

圖3：改進(jìn)的循環(huán)制備法的流路

通過(guò)柱選擇閥的切換，洗脫的目標(biāo)峰將沿著兩個(gè)通道移動(dòng)：從柱1到UV 1，到柱2，從柱2到UV 1，到柱1（見圖4）。每次切換后，峰都可以離開色譜柱進(jìn)入第二個(gè)UV檢測(cè)器（UV 2），然后通過(guò)收集器收集目標(biāo)峰。

（A：柱1→UV 1→柱2；B：柱2→UV 1→柱1）

我們采用這種改進(jìn)的循環(huán)方法對(duì)圖2示例中的萊苞迪甙A和甜菊苷的混合溶液進(jìn)行了分離，分離效果見圖5。藍(lán)色譜圖為UV1的循環(huán)檢測(cè)信號(hào)，紅色譜圖為UV2的監(jiān)測(cè)信號(hào)，從UV1的監(jiān)測(cè)信號(hào)中，我們可以看出，組分總過(guò)6次經(jīng)過(guò)色譜柱分離后，已基本實(shí)現(xiàn)了良好的分離，其分離效果較圖2的閉環(huán)循環(huán)提高明顯。兩個(gè)組分循環(huán)6次后，將終止循環(huán)，通過(guò)閥切換，組分進(jìn)入U(xiǎn)V2進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò)軟件的自動(dòng)峰識(shí)別對(duì)兩個(gè)組分進(jìn)行自動(dòng)收集。

圖5：改進(jìn)的循環(huán)制備法的分離萊苞迪甙A和甜菊苷（洗脫流速：3.5 ml/min；流動(dòng)相：70%水+30%乙腈；UV波長(zhǎng)210nm；樣品濃度：0.2mg/ml）

改進(jìn)的循環(huán)色譜方法，顯著提高了目標(biāo)峰的分辨率。雙檢測(cè)器的配置，可以在一次運(yùn)行中能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)并支持方法開發(fā)的過(guò)程。通過(guò)軟件上的自動(dòng)峰識(shí)別功能，就可以自動(dòng)識(shí)別峰和自動(dòng)收集，使得循環(huán)制備方法更加簡(jiǎn)便和重復(fù)。

圖8：LUMTCH Calmflow循環(huán)制備系統(tǒng)