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下面的分享中將介紹Orbitrap質譜上對8 種小分子藥物進行鑒定，并對譜圖準確度鑒定分子式的準確度進行評估。

1. 實驗方法

2. 數據分析

將從Orbitrap 獲取的所有質譜數據導入MassWorks（Cerno Bioscience, Norwark, CT）軟件，進行 sCLIPS（自校準線形同位素輪廓搜索）分析。sCLIPS 僅對峰形進行校準，以測量得到的單同位素峰為校準標準，將實際峰形函數轉化為已知的數學函數。將其應用于未知離子的整個同位素輪廓時，會轉化為具有相同已知峰形函數的校準同位素輪廓，隨后用于計算任何給定候選分子式的理論質譜圖，從而實現具有高譜圖準確度（SA）的精確同位素建模。

圖1：MassWorks中sCLIPS的分子式鑒定流程

3. 結果與討論

3.2 譜圖準確度的作用：

譜圖準確度已被證實在通過峰形校準確定元素組成的過程中，是排除假陽性分子式的有力指標。譜圖準確度方法與其他方法的根本區別在于，該方法使用校準后的輪廓質譜圖，進行精確的同位素建模，而其他方法要么采用過于簡化的棒狀（質心）質譜圖，要么使用假定峰形函數的輪廓質譜圖。先前研究表明，對于一組分子量大于 800 amu、質量誤差為 2 ppm 的化合物，基于譜圖準確度可排除高達 99% 的錯誤分子式。針對分子量小于 500 amu 的小分子的研究，也取得了類似結果。

八種化合物在通過峰形校準后的獲得了高的譜圖準確度，并成功將全部的分子式鑒定為排名第一或第二的結果，具體總結在圖2中。所有檢索均在非常寬松的條件下進行，涵蓋了大多數常見元素，且對其上下限沒有任何限制。若沒有譜圖準確度的輔助，要明確鑒定這些小分子將極具挑戰。

圖2：譜圖準確度鑒定8個化合物的分子式的結果

3.3 潑尼松的鑒定

以潑尼松（Prednisone）的分子式檢索為例， 其[M + H]離子的正確分子式 C??H??O?，在總共 44 個候選分子式中排名第一。圖 3 展示了排名前四的分子式及其精細同位素結構，以說明譜圖準確度在鑒定真正未知化合物方面的強大作用。真正的潑尼松分子式，含有碳、氫、氧元素，其 A+1 峰主要由 13C 貢獻，占比 23.5%；A+2 峰則由 13C13C 和 1?O 貢獻，占比 2.9% 。理論計算質譜圖（黑色）與校準質譜圖（紅色）之間，潑尼松具有高度匹配的同位素模式，這從其較高的譜圖準確度可以看出。排名第三和第四的分子式均含有氮原子，導致出現兩個不匹配的情況，使得譜圖準確度遠低于排名第一的結果。第一個不匹配源于 A+1 峰，由于分子中碳原子較少；同時，C??H??N?F?P 和 C??H??N?F?引入了第二個不匹配，因為實際化合物中不存在這樣的峰。雖然主要的譜圖誤差來自 A+1 峰，但 A+2 峰也存在明顯差異。

圖3：潑尼松的精細同位素結構分析

4. 結論：

1）大多數被研究的化合物，其分子式在MassWoks軟件中的譜圖準確度可達到或接近 98%。

2）譜圖準確度為成功鑒定未知化合物的分子式，提供了一種獨特且有效的方法。憑借譜圖準確度，所有化合物都被正確鑒定為排名第一或第二的結果。

2）對于大多數實際藥物雜質的鑒定，僅 3ppm 的質量精度，不足以實現高可信度的鑒定。而基于利用同位素精細結構對質譜峰形進行校準，能夠可靠地鑒定真正未知物的分子式。