H.E.L 生物合成研究：細菌的氣體培養--BioXplorer 生物反應器應用案例

前言

合成生物學（Synthetic Biology）是一門新興的跨學科領域，它結合了生物學、工程學、計算機科學、化學、物理學以及遺傳學等多個學科的知識和技術。合成生物學在生物制造領域的應用是其最引人注目的方面之一。生物制造，也稱為生物加工或生物生產，是指利用生物體（如細菌、酵母、真菌、植物或動物細胞）來生產化學品、燃料、材料和藥物的過程。

合成生物學在生物制造領域的優勢包括：

可持續性：生物制造過程通常使用可再生資源，如糖、淀粉或纖維素，而不是依賴于有限的化石燃料。

環境友好：生物過程往往產生較少的有害廢物和副產品，有助于減少環境污染。

成本效益：隨著技術的進步，生物制造過程可能會變得更加經濟高效，因為它們可以減少能源消耗和原材料成本。

正是由于生物合成有諸多的優勢，現在引起了人們的極大興趣。

案例：通過CO2、H2和O2高密度培養真養產堿桿菌生產聚（D-3-羥基丁酸鹽）的研究

背景：微生物聚酯由于其在工業生產生物可降解塑料中的潛在應用，最近引起了相當大的關注和興趣?，F在已經發現許多細菌菌株具有在細胞內積累聚羥基烷酸（PHAs）的能力。在PHA產生細菌中，真養產堿桿菌Alcaligenes eutrophus是研究得最透徹且在PHAs研究中最廣泛使用的菌株。這種微生物最初被分離為一種氫氧化細菌，能夠利用二氧化碳、氧氣和氫氣作為底物自養生長，并在氧氣和或營養限制的培養條件下在細胞內積累聚-D-3-羥基丁酸（P(3HB)）。因此，利用能夠同化二氧化碳的Alcaligenes eutrophus生產可生物降解塑料，在很大程度上有助于解決兩個環境污染問題：（i）大氣中二氧化碳水平的增加，以及（ii）不可生物降解塑料廢物的處理。然而，在大規模和經濟地應用Alcaligenes eutrophus的自養培養之前，需要克服相當大的技術挑戰。其中，特別是隨著培養容器中底物氣體的耗盡，利用效率的損失問題，以及可能發生的嚴重氣體爆炸的潛在風險，需要特別處理。

研究方法：在自養培養過程中，需要消除氣體爆炸的可能性。研究者開發了一個帶有安全特性的閉路循環培養系統，通過維持底物氣體相中的氧氣濃度低于氣體爆炸下限（6.9%）來實現安全培養。使用了一個帶有籃子式攪拌器的培養容器，這種攪拌器的設計使得KLa（氧傳遞系數）達到了2970h-1。此外，氧氣氣體也直接從其他氣體中分離出來，單獨供給發酵器。

結論：在氧氣限制條件下，經過40小時的培養，獲得了91.3 g.dm-3的細胞和61.9 g.dm-3的P(3HB)。這些結果與通過異養發酵大規模生產P(3HB)的報道結果相比具有優勢。特別設計的籃子式攪拌器在提高KLa值方面發揮了關鍵作用，這對于在低氧濃度下維持高細胞密度和P(3HB)生產至關重要。

產品應用

生物合成：Alcaligenes eutrophus細菌培養以生產聚(D-3-羥基丁酸)（P(3HB)）的詳細步驟：

? 培養準備：

使用Alcaligenes eutrophus ATCC 17697菌株。準備礦物質培養基用于預培養和主培養。

? 種子培養：

在實驗室規模的循環氣體封閉回路培養系統中，使用200 cm3規模的罐式發酵器進行種子培養。

? 主培養：

將100ml種子培養液用于在實驗工廠規模的培養系統中進行主培養。

? 培養條件：

工作體積設為1 dm3。使用pH控制器自動添加12%氨水，維持pH值在7.0。溫度維持在30℃。攪拌速度設為700 rpm。底物氣體混合物的供給速率為2 dm3/min（相當于2vvm，即每分鐘體積通風率）。

? 氣體循環系統：

使用玻璃罐式發酵器（總體積2 dm3）作為反應器。氣體室（總體積2 m3）充滿氫氣、氧氣和二氧化碳。氣體通過泵混合，然后通過無菌過濾器和循環泵送入發酵器。發酵器中未消耗的氣體返回氣體室，并通過氣體回流線再次供應給發酵器。

? 安全措施：

安裝壓力傳感器，當內部壓力超過0.5 kg/cm2時，將氣體排放到室外。所有電氣設備均為防爆型。氣體室和所有相關設備安裝在室外，氣體回收線用油絕緣處理。使用可燃氣體探測器與氣體供給線的關閉裝置相連，以便在檢測到系統泄漏時中斷氣體供應。

? 氧氣供應：

通過防爆電磁閥和溶解氧（DO）控制器，間歇性地將純氧直接供應到培養液中。DO控制器的初始設定值為1.8 ppm，隨著發酵過程的進行，手動降低設定值，以確保返回線中的氧氣濃度不超過爆炸下限。

? 監測與分析：

使用氣相色譜法測定氣體相的組成。使用膜型DO電極監測培養液中的溶解氧濃度。通過光譜光度計測定細胞濃度，并將其轉換為干細胞重量。通過氣相色譜法測定P(3HB)的濃度。

? KLa值測定：

使用亞硫酸鹽氧化法在以下條件下測定KLa值：工作體積1 dm3，通氣率2 vvm，攪拌速度700 rpm，溫度30℃。

? 發酵結果：

初始氣體混合物組成為H?:O?:CO? = 85.2:6.3:8.3。隨著培養的進行，微生物指數增長，特定生長率約為0.25 h?1。當細胞濃度增加到約10.1 g.dm?3后，溶解氧濃度降至約0 ppm，此時開始積累P(3HB)。在氧氣限制條件下，經過40小時培養，細胞濃度增加到約91.3 g.dm?3，P(3HB)濃度為61.9 g.dm?3。

H.E.L的BioXplorer 生物反應器專為生物培養、生物合成設計：從培養條件控制（溫度、攪拌、pH）、自動液體氣體進料、代謝狀態監測（細菌濃度、尾氣分析）、實時在線數據記錄分析等方面為客戶提供完全的解決方案。

來源：Tanaka, K., Ishizaki,A., Kanamaru, T., & Kawano, T. (1995). Production of poly(D-3-hydroxybutyrate) from CO2, H2, and O2 by high cell density autotrophic cultivation of Alcaligenes eutrophus. Biotechnology and Bioengineering, 45(3),268-275. 

關于HEL：

H.E.L——Hazard Evaluation Laboratories 成立于1987年，總部設在倫敦，在中國、美國、德國、意大利、印度擁有分公司。全資的赫伊爾商貿（北京）有限公司于 2020年在北京設立。

H.E.L最初是一家過程工藝優化及反應危害評估的專業咨詢機構，對研究機構和生產企業承接工藝過程研發項目；同時提供安全咨詢，包括事故調查、HAZOP研究、安全設施的設計及制度管理等。目前，H.E.L是全球首屈一指的過程工藝及安全專業咨詢機構，同時已經發展成為一家致力于為客戶提供專業的過程工藝優化及反應危害評估設備的國際集團企業。

關于綠綿科技

　　2001年成立的北京綠綿科技有限公司(簡稱：綠綿科技)以體現客戶服務價值為宗旨，以專業精神和技能為廣大實驗室分析工作者提供樣品前處理、樣品制備及分析、實驗數據精確分析和管理的全面解決方案，致力于協助客戶提高分析檢測的效率和水平。

　　主要代理產品：GC/MS/MS,LC/MS/MS新機租賃業務/LUMTECH循環制備液相/靜音型雙頻超聲清洗/Knauer研發，中試和生產脂質納米顆粒（LNP)碰撞噴射混合器系統/冰點滲透壓儀、液相/超高壓液相色譜儀、在線SPE液相色譜儀/法國F-DGSi氮氣，超高純氫氣氣體發生器，液氮發生器/Cytiva生命科學設備/LabOS實驗室運營系統/MassWorks準確質量數測定及分子式識別系統/MsMetrix氣質香精香料分析軟件/Sin-QuEChERS農殘凈化柱/制藥企業質量回顧性報告系統（QRS)/英國赫伊爾生物反應器，電池絕熱量熱、催化劑合成。

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