馬匹中生長激素濫用：IGF-1質譜識別和定量程序的初步評價
針對賽馬中生長激素（GH, 生長激素）濫用的懷疑，目前已將更多的精力放到GH檢測方法上，由于其半周期小于15 min，這種激素的檢測窗口非常短，因此需要識別其它可能的次級標記物進行研究。研究表明，對馬或牛進行生長激素給藥后，發現血漿中類胰島素生長因子1（IGF-1）的濃度大大提高。IGF-1是由70個氨基酸組成的、質量數為7.5 kDa的蛋白質，用于細胞生長和繁殖，在人體和馬匹中其結構是相似的。相對于本底濃度，對純種馬GH給藥后，IGF-1濃度大大增加的重要性進行了研究。超過來自三個大洲的2000個賽馬（包含不同性別、年齡），對IGF-1的濃度進行了檢測，平均濃度為310 ng/ml。通過GH處理過的受體，IGF-1大大超過其本底濃度，平均超過4倍。這清楚表明，設定IGF-1的閾值是可能的，血漿中設定在700 ng/ml左右，超過這個值，就表明GH濫用。
對于IGF-1的研究，人體中IGF-1免疫放射分析（IRMA）方法（DSL-2800, Diagnostic Systems Laboratories, Webster，TX, USA）驗證后也適用于馬血漿的分析，表明這個可靠、耐用方法適合作為檢測馬血漿中IGF-1是否超過閾值的篩選方法。但是，馬血漿中的其它受體也可能與人類IGF-1抗體顯示某些交聯反應，這時這種免疫診斷分析的特異性就很難進行評價，對于GH濫用的起訴，需要更特異、更準確的IGF-1定量方法，方法學上也要求證明被定量的物質就是IGF-1，也就是具有高度的特異性。質譜被證明特別適合于這類分析，也經常用于檢舉和起訴的目的。
本文研究了一個LC-ESI-MS方法，用于血漿中低濃度IGF-1的定量，為了確保被定量的物質是IGF-1，至少在部分上說明這個蛋白質的結構是必要的。選擇的鑒定方法，包括蛋白質的酶解，酶解后的多肽大部分成為合適的小分子（10個氨基酸殘基或更小）。串聯質譜實驗（MS/MS）得到更多碎片能夠與酶解的肽結構關聯起來。酶解肽的色譜分離的保留時間，結合分子量，必須與IGF-1標準品符合。另外，這些肽的MS/MS碎片質譜圖也必須與期望的結構一致，必須與IGF-1標準品得到的結果一致。
與IGF-1相關的化合物，Arg3-IGF-1作為內標，它是市場上可以買到的高純度研究級蛋白質。利用精氨酸殘基（Arg3）取代存在馬體中IGF-1的一個氨基酸殘基（Glu3）。IGF-1的多細胞抗體與這個內標具有高的交聯反應，意味著可實現有效的親和色譜分離，由于IGF-1與Arg3-IGF-1的結構不同，這個極性差別使HPLC分離成為可能，為IGF-1的定量提供了基礎。
實驗部分 試劑 重組IGF-1（受體級）和重組Arg3-IGF-1（受體級）來自于GroPep（Adelaide, Australia）。內源蛋白酶Glu-C（V8 蛋白酶）和內源蛋白酶Asp-N均為測序級采購自Roche Diagnostics（Mannheim, Germany）。乙腈和甲醇來自Riedel-de Haen（Seelze, Germany）。二硫代蘇糖醇和三氟乙酸來自Sigma（St. Louis, MO, USA），乙酸氨來自Merck（Darmstadt, Germany）。 IGF-1的內源蛋白酶Glu-C酶解 方法參考先前使用IGF-1酶解方法。將重組IGF-1（20 ug）溶解在500 ul乙酸氨緩沖溶液（50 mM, pH 6.7）中，以1: 1（酶/底物）比例將內源蛋白酶Glu-C加入，接下來在37℃培養40 h，然后加入三氟乙酸使其終濃度達到0.5%（終止酶解反應），后將樣品保存在-8℃下。樣品僅僅在需要定性分析前進行解凍。 IGF-1的內源蛋白酶Asp-N酶解 下面的酶解程序基于前面描述的方法。將重組IGF-1（20 ug）溶解在500 ul乙酸氨緩沖溶液中（50 mM, pH 8.0），以1: 200（酶/底物）的比例加入Asp-N，接下來在37℃下培養15 h，為了減少酶解肽中的二硫鍵合，添加二硫代蘇糖醇使其濃度達到4 mM，30 min后加入三氟乙酸使其終濃度達到0.5%，后保存在-8℃條件下。樣品僅僅在需要定性分析前進行解凍。 液相色譜 HP 1090系列II型HPLC（Palo Alto, CA, USA），每個研究使用不同的流動相組成，這在相關的部分進行了描述。流速為250 ul/min，在柱前利用Upchurch Scientific分流器（Oak Harbor, WA, USA）進行分流，使進入Jupiter C18 250 x 1 mm i.d., 5 um, 300 Å色譜柱（Phenomenex, Torrance, CA, USA）的流速為50 ul/min，色譜分離在40℃條件下進行。 質譜 HPLC流動相通過ESI接口引入到Finnigan LCQ離子阱質譜（Thermo, San Jose, CA, USA），LCQ質譜具有MSn分析能力，利用Xcalibur軟件控制。全部分析過程的離子源電壓為4.50 kV，毛細管溫度為200℃。鞘氣氣流為60 units、輔助氣流為1 unit。離子捕獲時間手動設定為100 ms、使用3個掃描時間段。對于MS/MS分析，母離子隔離寬度為3 Th、碰撞能為35%。 IGF-1的定性分析方法 HPLC流動相：1%甲酸的水溶液（A）和1%甲酸的乙腈溶液（B）。梯度條件：3%B運行5 min后，在45 min內增加到60%，然后在5 min內增加到90%，后保持5 min。對于兩個IGF-1酶解樣品，分別進樣5 ul進行分析。掃描范圍 m/z 300- 1500進行全掃描分析，利用Pepcut功能（Xcalibur Bioworks, Thermo, San Jose, CA, USA）分析內源蛋白酶酶解多肽的電荷狀態和質量數。選擇每個酶解肽的豐度大的多電荷離子為母離子，進行碰撞研究進行MS/MS實驗。利用Sequest軟件（Thermo Xcalibur Bioworks）測定觀察碎片和理論碎片的相關性。 IGF-1的定量分析方法 使用等度HPCL流動相：1%甲酸水/乙腈（73: 27, v/v）。IGF-1和Arg3-IGF-1的混合樣溶解在流動相中為校正樣，取2 ul注入HPLC，用于測試結果中ng量的指示。m/z 940- 1300的全掃描分析適用于IGF-1和Arg3-IGF-1，利用Thermo的Xcalibur Bioworks蛋白質軟件，對多電荷蛋白質信號進行去卷積處理，得到質譜的中性分子量。 結果和討論 IGF-1的定性分析方法 對于低含量的IGF-1的酶解，使用不同的水解酶并對結果進行了評價。對蛋白的消解來說，胰島素是常使用的。然而結果表明：酶解率低、無法識別的非特異性酶裂解。這些也能在胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶酶解方法中發現。氰溴酸處理導致蛋白質復性的低產率，而嗜熱菌蛋白酶酶解是不完全的。 低的酶解產率和非特異性酶解可能是由于IGF-1的三個二硫鍵在空間上限制了蛋白分解酶接近理論分裂位點。沒經過后還原的衍生過程，可觀察到二硫鍵的重組現象。在接下來的研究中，利用二硫代蘇糖醇還原二硫鍵，自由巰基利用碘乙酸進行乙酰基化，或利用次乙亞胺進行乙氨基化，或利用乙烯基吡啶進行吡啶亞基化衍生。在典型低濃度IGF-1的血漿中，衍生是不完全的或者IGF-1衍生物的產率太低，以至于不能得到需要的靈敏度，樣品也顯示了很高的質譜分析背景。接下來研究集中在水解酶上，酶解未還原（二硫鍵未動）的IGF-1，得到具有高產率的幾個酶解肽，然后未動的二硫鍵利用后水解進行還原。 研究采用IGF-1的內源蛋白酶Glu-C酶解，酶作用在谷氨酸殘基的羧酸鏈進行斷裂，利用內源蛋白酶Glu-C對非還原的IGF-1的酶解得到7個酶解物，這些可通過全掃描LC-MS觀察到（表1）。除了預期得到的酶解產物，在IGF-1的Gly32、Asp12、Asp20和Asp53位羧基端的非特異、重復斷裂也能被觀察到。其中的兩個三肽，對于IGF-1僅僅給了有限的結構信息，而另外兩個肽通過二硫鍵互相連接，正象在天然IGF-1觀察到的一樣。利用二硫代蘇糖醇處理后，含自由巰基（還原的）肽的產率非常低，這些物質的MS/MS實驗僅能得到有限的碎裂信息。
IGF-1利用內源蛋白酶Glu-C酶解后，給出IGF-1的一些結構信息，但這些特征仍不能滿足現在研究需要，因此需要利用內源蛋白酶Asp-N對IGF-1進行酶解，這個酶能引起天冬氨酸殘基的氨鏈斷裂，接下來通過二硫代蘇糖醇處理將二硫鍵還原。LC-MS分析表明，酶解和還原過程產生了7個含自由巰基的肽段，針對IGF-1序列的每個肽段，組合在一起代表了它的全序列（表2）。利用這些數據可以組建IGF-1的酶解圖（見圖1）。可以看到在Glu58的氨基端具有非特異性斷裂，而在其它的Glu殘基上沒有發現，可能是由于這個位置具有更易斷裂的結構，因此得到了兩個未預測到的肽段，肽段7是肽段6的一個Met59氧化形態。150 ng酶解的IGF-1得到的LC-MS全掃描譜圖（m/z 300- 1100）顯示了很強的峰（圖2a）。
IGF-1碎片峰的識別通過m/z信號相對預期得到的酶解肽段（圖2b）的重組色譜圖進行了確認，觀察到的多電荷離子列在表2中，圖3a和圖3b分別顯示了肽段3和肽段7的譜圖。雖然肽段1和肽段2在液相中沒有實現基線分離（保留時間分別為50.22和50.47 min），但他們具有不同的質量數，因此在定量分析中不會影響結果。
就像前邊利用MS/MS檢測一樣，接下來對還原的酶解物進行HPLC分析，對于每一個酶解肽段，雙電荷離子（或者豐度更大的多電荷離子）被選擇作為母離子，正象表2中列出的一樣。MS/MS結果對于肽段的碎裂提供豐富的信息（表3）。既然肽段3（序列20-44, 通過MS/MS得到結構信息通常分子尺寸是太大的）分析揭示了氨基酸殘基在肽的羰基端。通過Xcalibur Bioworks Sequest軟件，觀察到的肽酶解碎片與IGF-1的理論碎片實現了很好的符合。肽段5和肽段1的碎片譜圖作為例子顯示在圖4a和圖4b。
IGF-1的定量分析方法
選擇Arg3-IGF-1作為內標用于IGF-1的定量，該化合物在結構和分子量上與馬中的IGF-1是高度相近的，它具有70個氨基酸殘基，一個氨基酸殘基（Glu3）被精氨酸殘基（Arg3）取代。使用這個蛋白質作為內標，是由于它在分子尺寸上與IGF-1相似，而且IGF-1的多細胞抗體同Arg3-IGF-1也有很高的交聯反應，當使用親和色譜作為馬血漿樣品中IGF-1濃度檢測的分離條件，這點是非常重要的方面。設計的IGF-1定量分析LC-MS方法，包含分析該蛋白質和未經任何處理的內標物。當分析復雜樣品時，全掃描檢測方法的選擇性使共提取物的信號排除。然而，由于Arg3-IGF-1（7675.8）和IGF-1（7648.8）非常相近的分子量，這些蛋白的多電荷形式更加接近，因此這兩個蛋白的色譜分離非常重要。由于內標在Arg3鏈端具有一個自由氨基（而IGF-1沒有），因此這兩個蛋白具有不同的極性。這個特點可通過反相HPLC進行研究，實現了這兩個相似化合物的基線分離，Arg3-IGF-1和IGF-1的保留時間分別為2.7 min和4.9 min。
這些蛋白質的質譜圖顯示了6和8質子化作用（6-8個正電荷），強峰是[M+7H]7+，觀察到IGF-1的質核比是m/z 1093.4（理論值 m/z 1093.5），Arg3-IGF-1的質核比是m/z 1097.2（理論值 m/z 1097.5）。這些蛋白的質量數通過軟件的去卷積選項進行了確認。為了定量，選擇m/z 940- 1300的掃描范圍，譜圖包含了[M+6H]6+、[M+7H]7+和[M+8H]8+物質的信號，確認這些峰確實是IGF-1和內標的信號。m/z 1093.4 (±0.5)和1097.2 (±0.5)的信號分別被選擇用于IGF-1和內標的定量。IGF-1在30- 500 ng（柱上濃度）濃度范圍內，利用IGF-1/內標的比例、內標濃度為200 ng（柱上濃度），得到了很好的線性，相關系數（R2）為0.9974（n=6），見圖5a和圖5b。定量限（LOQ）在柱上濃度為30 ng時進行了測試，即使在這么低的濃度下，也可觀察到IGF-1和內標物高度特征譜圖（見圖5c和圖5d）。更低濃度的線性沒有進行測試。應用這個方法用于馬血漿中IGF-1的定量成為目前研究的基礎。
結論
本文開發了用于IGF-1定量的物質確定識別、IGF-1的定量方法。這包括在低濃度未還原（二硫鍵完好）IGF-1的酶解方法選擇，為了得到自由巰基的酶解肽段，接下來進行酶解后還原這些二硫鍵。IGF-1利用內源蛋白酶Asp-N酶解后，接下來利用這種方式還原，然后進行全掃描LC-MS分析，可得到高度特征的色譜和質譜指紋譜圖。為了清晰起見，給出了柱上濃度為150 ng（IGF-1）的分析結果，但濃度為20 ng得到的數據也很容易被解析。由于非特異的酶解反應，觀察到兩個酶解肽段，一個肽段也在蛋氨酸氧化態形式額外觀察到，酶解肽段和預測的肽段是不一致的。酶解肽段的ESI-LC-MS/MS分析，表明得到的碎片與理論碎片（通過質譜計算機軟件產生）具有很好的一致性。正確酶解肽段的關聯技術，結合這些肽段的期望碎片，樣品和IGF-1能被看作高度特異的識別方法。
開發了一個ESI-MS全掃描方法用于低濃度IGF-1的定量，使用Arg3-IGF-1作內標，在柱上濃度為30 ng（LOQ）到500 ng之間，得到了很好的線性。全掃描代替選擇離子監測用于IGF-1和內標的定量，這不僅通過色譜保留時間，也通過特征的電噴霧質譜多電荷離子形式，使這些物質識別成為可能。
這個初級研究描述的方法，正被應用于馬血漿中IGF-1的濃度檢測。IGF-1的濫用閾值設定在700 ng/ml左右，并得到幾毫升馬血漿樣品，這個方法很適用于IGF-1的高靈敏度定性與定量分析。
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