液相色譜常見21個問與答
1. 在不能確定用什么色譜柱合適時, 應該先試用哪種柱子?
答：一般來說先試用 C-18 或 ODS 柱(ODS 就是 C18 的意思)。C18 柱適用范圍廣，容易得到良好的分析和分離結果。而且 C18 柱穩定性好，使用壽命長，性價比高。
2. HPLC 系統的基本構成是什么?
答: 能正常工作的 HPLC 系統必須包括: 進樣器、泵、檢測器、和數據處理器(電腦和軟件)。要想得到更好的分析結果，還可以再加上脫氣機和柱溫箱。
HPLC 系統的配置方法基本上分兩種：一是將所有的配件整合在一起，另一種是模塊化設計，各個配件模塊可以隨意組合。
（LUMTECH制備液相）
（ECO plus GPC）
3. HPLC 的品牌和型號眾多, 哪一種適合我呢?
答：雖然儀器指標和價格很重要，但它們并不是的決定因素。許多 HPLC 的使用者覺得這些指標的意義很難理解；有的銷售人員給出的指標甚至具有誤導性。因此，您還可以參考考慮以下幾個因素:
1) 真正儀器用戶的意見；
2) 親手試用儀器或參加儀器實際演示；
3) 經銷商的售后服務能力；
4) 儀器維護費用；
5) 將來儀器能否升級。
4. 進樣器有哪些重要指標?
答：進樣器的重要指標包括：重復進樣的重現性、進樣范圍以及線性進樣范圍、和交叉污染。當您只想用 1~2 個標準溶液制作標準曲線時，或者樣品的濃度范圍很大時，進樣器的線性范圍就顯得尤其重要。進樣交叉污染對痕量分析結果的可靠性至關重要；有時侯甚至需要在每一次進樣前后，都運行復雜的清洗程序以克服交叉污染。
手動進樣閥和自動進樣器
5. 高壓梯度泵和低壓梯度泵有何不同?
答: 在低壓梯度泵系統中，不同的流動相先經過混合閥混合后才進入泵頭。低壓梯度泵系統比較經濟，因為它只有一個泵頭。您可以使用多種流動相，成本不會太高。
在高壓梯度泵系統中，不同的流動相由不同的泵頭輸送，然后在泵出口處混合。它提供了比低壓梯度泵快得多的梯度, 這是因為溶劑的混合點非常接近柱頭的緣故。
梯度反應的快慢可以用滯后體積來衡量。高壓梯度泵的滯后體積在 50-300 微升之間，而低壓梯度泵的滯后體積可以是前者的 2~3 倍。當分析時間短或者流速很低時，一個小的滯后體積是非常重要的。如果滯后體積太大，就無法得到重現性好的淋洗梯度；因為設定的梯度尚未到達柱頭前，分析運行已經完成。
（Calmflow plus4.1S高壓泵）
（Calmflow plus 6.1L四元泵）
6. 恒流(Isocratic)泵有哪些重要指標?
答: 恒流泵的指標包括: 大工作壓力、流速范圍、流速的重現性和準確度、壓力波動、壓力監測與過壓停機。
（體積很小的恒壓泵）
7. 梯度泵有哪些重要指標?
答: 梯度泵的指標包括: 大工作壓力、流速范圍、流速的重現性和準確度、梯度的重現性和準確度、滯后體積、壓力波動、壓力監測與過壓停機。
8. 在線脫氣機是必須的嗎?
答: 永久氣體在不同的溶劑中溶解度不同。當不同的溶劑在線混合時，溶解于原溶劑中的氣體會因在混合溶劑中的溶解度不同而釋放出來。作為證明, 您可以做一個小實驗：加一些水到甲醇中— 您會看到許多氣泡冒出來了。如果 HPLC 使用的是低壓梯度泵, 這些氣泡會影響泵頭的工作和使基線噪音增大,并且導致保留時間的改變。因此在線脫氣機是必須的。對于高壓梯度泵來說, 因為液體的混和是在經過泵之后，氣泡的影響要小一些。如果條件允許，還是建議使用在線脫氣, 有助于降低基線噪音。
如果使用的是恒流泵，脫氣機就不是那么必須了。因為在真空過濾溶劑時，已經將大部分的氣泡除去。
9. HPLC 檢測器有哪幾種?
答: 現有的檢測器有： UV 檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器(包括極譜、庫侖、和安培檢測器等)、電導檢測器、示差折射率檢測器、蒸發光散射檢測器、手性檢測器、放射性同位素檢測器和質譜檢測器。
10. 如何選擇合適的 HPLC 檢測器?
答：檢測器的選擇要依據分析的對象和目的來確定。包括分析物的類型與含量、檢測的靈敏度和選擇性、是否需要化合物分子結構的信息等。
UV 檢測器是性能可靠和應用廣的檢測器。如果分析物在 200 納米以上有吸收，UV 檢測器可謂佳之選。而對于某些大的芳環類化合物 (如多環芳烴)，選用熒光檢測器可能將檢測靈敏度提高 10~100 倍。
電化學檢測器用于易發生電化學氧化還原反應的化合物：例如酚類、芳香胺類、和一些碳水化合物。因為選擇性強，所以對上述化合物的檢測靈敏度要高于UV 檢測器。但是, 由于電極與柱流出液直接接觸并與其中的化合物發生反應,其電化學響應可能不如 UV 檢測器那樣穩定。
電導檢測器也是一種電化學檢測器, 它是離子色譜常用的檢測器; 主要用于測定無機陰陽離子, 和部分極性有機物 (如一些羧酸) 等。
示差折射率檢測器可檢測任何一種化合物, 但是它的靈敏度要比 UV 檢測器低100 -1000 倍。它的另一個應用限制是不能進行梯度淋洗。因此, 示差檢測器主要用于弱紫外吸收的有機化合物; 例如小分子有機酸、碳水化合物、和一些聚合物的檢測。
蒸發光散射檢測器的應用范圍與示差檢測器相近, 但它可以用于梯度淋洗。它的主要限制因素是需要使用大量的氮氣來蒸發掉流動相。
質譜檢測器的應用越來越廣泛, 盡管它的價格比其它種類的檢測器高 10~20 倍。它是一種兼具高特異性和高靈敏度的通用型檢測器。與傳統檢測器相比, 它在定性和定量方面都有很大的優點。它不僅能夠給出普通色譜圖, 而且可以提供化合物的分子結構信息。
11. 如何選擇紫外檢測器的流通池?
答: 如果流通池過大, 兩個相鄰的峰有可能在流通池中混合在一起; 如果流通池太小, 到達光檢測元件的光太少而可能使噪音過高。較高的柱前壓也會限制流速的范圍從而影響流通池的選擇。
我們可以根據信號峰的大小來選擇流通池。 如果峰型狹窄, 需要的流通池就小。一般來說, 流通池的體積應該不大于峰體積的 1/3。譬如在峰寬是 0.1 分鐘時的流通池體積：如果流速為 1 毫升/分鐘, 則不應該大于 33 微升; 如果流速為0.01 毫升/分鐘則約為 0.3 微升。
12. 如何選擇相似的 C18 柱?
答: 不同廠家提供的 C18 柱或 ODS 柱的 HPLC 譜圖差別可能相當大; 其原因是所用硅膠的性質、碳覆蓋率和表面積等差別都很大。如果要想在同樣的條件下得到相同的譜圖, 就要用同一廠家的產品。如果想要試用性質類似的 C18 柱, 可以選擇硅膠的性質、碳覆蓋率和表面積都很接近的柱子。
13. 怎樣選擇保護柱?
答: 保護柱的體積應該小于分析柱的十分; 柱內填料也要與分析柱類似。如果做不到, 可以選擇保留能力比分析柱弱一些的保護柱。
14. 色譜柱的重要指標有哪些?
答: 這些指標包括: 柱效、惰性、重現性、耐用性和 pH 范圍, 以及不同批次的色譜柱之間分析結果的重現性。
15. 怎樣選擇手性柱?
答: 一對手性分子能否被某一手性柱分開是很難說的。因此, 好的方法就是查找文獻看有無現成的方法, 或者將樣品送到手性柱廠家做試分離。
16. 封尾型反相色譜柱有什么優越性?
答: 當硅膠表面鍵合了 C18 或者 C8 等基團后, 硅膠表面仍然有殘存的硅羥基(SiOH)。這些硅羥基可能同離子型的化合物發生二級反應, 導致峰型不對稱或者拖尾。特別是當流動相中含有金屬離子, 或者是在分析分離堿性化合物的情況下,二級反應尤為嚴重。當用小分子硅烷將裸露的硅羥基鍵合封尾后, 二級反應即被大大降低。但是, 封端基團在酸性的條件下容易水解; 因此, 封尾柱不宜在 pH<3的情況下使用。
17. 怎樣延長色譜柱的使用壽命?
答: 流動相和樣品應事先過濾; 確認流動相的 pH 范圍在色譜柱的規定工作范圍之內。如果色譜柱有一段時間閑置不用, 應該用甲醇或乙腈做后清洗。
（LUMTECH新軸向加壓制備色譜柱，通過可調整柱端的螺絲進行軸向調整，可以再調整柱床長度的30%（25-40mm），保證制備柱性能不變，延長使用壽命。）
18. 在反相液相色譜中, 為什么乙腈和甲醇是常用的流動相?
答：因為乙腈和甲醇可以和水以任意比例混合。而且在紫外測定范圍內，乙腈的透明度很高；甲醇雖然有吸收，但它是常用的樣品溶劑流動相和溶劑一致時可以減少背景的吸收。此外，它們也容易得到。
19. 用乙腈和甲醇做流動相有何不同?
答: 乙腈在近紫外區(200~210 納米)幾乎沒有吸收; 如果分析物(如小分子有機酸)在這一波長段有吸收的話, 乙腈將是佳的選擇。乙腈也非常適用于高流速或柱子部分堵塞時的情形, 因為用乙腈時的柱壓比用甲醇時低的多。甲醇大的優勢是價格低廉; 而且它比乙腈穩定。當乙腈長時間暴露于常見光下時, 有可能形成聚合物并堵塞 HPLC 的閥和過濾頭。因此, 乙腈好盛放于棕色的玻璃中。
20. 正相 HPLC 和反相 HPLC 有何不同?
答: 在反相 HPLC 系統中, 流動相是極性的, 色譜柱填料則是非極性的。所以, 極性強的化合物比極性弱的先被沖洗出色譜柱。而正相 HPLC 的情況則完全相反— 色譜柱填料是極性的, 而流動相是低極性的; 弱極性的的化合物較快被洗出。
目前應用多的是反相 HPLC, 因為它的應用范圍廣, 結果重現性好, 溶劑也容易處理。而正相 HPLC 的保留時間易改變, 這是由于水分被硅膠填料慢慢吸附所造成的。正相 HPLC 難以做梯度洗脫。但是, 正相 HPLC 在異構體和弱極性化合物的分離上效果不錯, 而這正是反相 HPLC 的弱項。
21. 哪一種參數能好的反映工作中的 HPLC 的儀器狀態?
答: 泵壓。它反映了色譜柱和整個 HPLC 系統的狀況。壓力過低(譬如<10 巴)表明有漏液現象; 壓力過高說明柱子或者管路堵塞。壓力波動大(例如從 10 巴到>50 巴), 可能是泵入口處堵塞, 系統內有氣泡, 或者進樣閥出了故障。要養成隨時注意泵壓的好習慣。
（加拿大博朗科技 萬海濱
作者從事色譜分析的技術支持多年，以上是對于常見問題的一個總結。希望對從事色譜分析的同仁能有所幫助。如果您的問題在這里沒有答案，可以給我們發個郵件marketing@lumtech.com.cn。我們會盡力為您解答。）
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