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前言

　　全柱成像毛細管等電聚焦(iCIEF)電泳已成為生物制藥領域治療性單克隆抗體(mAb)電荷異質性分析的一項重要技術，無需傳統CIEF方法的遷移步驟即可通過紫外實時成像的方式完成蛋白分離和定量檢測。除了電荷異構體的定量分析之外，通過在線電噴霧電離質譜(ESI-MS)的方式直接表征分離的電荷異構體對于研究單克隆抗體的產品質量、安全性和有效性至關重要。iCIEF-MS串聯技術將iCIEF的高分離效率與MS的強大的表征能力相結合，可以對單克隆抗體的電荷變體進行深度表征。

　　<本文節選并譯自 Schlecht J, Moritz B, Kiessig S, Neusü? C. Characterization of therapeutic mAb charge heterogeneity by iCIEF coupled to mass spectrometry (iCIEF–MS). Electrophoresis. 2022;1–9.>

　　單克隆抗體由于性質和制造復雜，容易出現結構異質性，特別是電荷異質性。單抗的儲存降解也會產生電荷異質性，從而對結合效率和治療效果產生潛在的負面影響。全柱成像毛細管等電聚焦(iCIEF)技術在生物制藥領域經常被用于電荷異質性的測定，在治療性單抗的開發和質量控制中已經被公認為是一種非常可靠的常規方法。

　　iCIEF采用毛細管全柱成像檢測(WCID)的方式監測抗體的分離過程并通過紫外法對抗體含量進行定量檢測，整個檢測無需傳統CIEF方法的遷移步驟，在許多情況下已經取代了傳統的CIEF方法而成為生物制藥領域中電荷異質性分析的首選方法，因為它具有更優越的分辨率，沒有遷移步驟，從而縮短了分析時間(每個樣品<15分鐘)，減少了費力的樣品制備，以及更快的方法開發時間。

　　抗體電荷異質性的研究除了各電荷異構體的分離及定量之外，通過電噴霧電離質譜(ESI-MS)技術直接表征分離電荷異構體，對于確保單克隆抗體的產品質量、安全性和有效性也至關重要。

CEInfinite iCIEF分析兼制備型全柱成像毛細管電泳系統

　　AES公司創新的分析兼制備的CEInfinite 全柱成像iCIEF系統，成功地實現了iCIEF與ESI-MS串聯，通過將iCIEF的高分離效率和UV定量結果與MS的表征能力相結合，可以對單克隆抗體電荷異構體進行深度表征。只需簡單的優化方法參數，就能成功地將單抗的各電荷異構體峰從iCIEF轉移至MS分析。盡管電荷異構體峰從iCIEF轉移出來的過程中會在一定程度上降低異構體峰間的分辨率，但借助高分辨的MS平臺，即使是從低豐度的電荷異構體中分離出完整的單抗電荷異構體，包括脫酰胺、糖基化修飾等，都可以被高精度地表征出來。這就為生物制藥應用中的單抗電荷異質性表征提供了巨大的潛力。

　　（1）iCIEF-MS串聯系統的組成

圖1A展示了CEInfinite和Thermo Orbitrap Fusion Lumos 串聯的示意圖。CEInfinite電泳系統包括一臺自動進樣器，一個用于加壓遷移的蠕動泵，以及一個成像檢測器(UV)、一個iCIEF毛細管卡盒（包含三個部分：進樣毛細管、分離毛細管、轉移毛細管）。iCIEF毛細管卡盒的進樣毛細管端連接到自動進樣器內的六通閥接口，轉移毛細管端連接ESI接口。樣品通過六通閥導入iCIEF毛細管卡盒的分離毛細管部分，兩端的電極分別浸入陽極液和陰極液液面以下。電極施加高電壓后，抗體在分離毛細管中完成iCIEF分離，之后由蠕動泵提供動力，將轉移流速控制在10 ~ 80 nl/min(分離毛細管內徑為200μm)，這時分離毛細管內的電荷異構體將依次被轉移至ESI源電離并進行MS分析。

圖1 (A) CEInfinite iCIEF與ESI-MS串聯的原理圖，iCIEF系統帶自動進樣器、注射泵、毛細管柱，毛細管柱出口連接ESI接口；(B) 曲妥珠單抗的iCIEF-UV譜圖(濃度2 mg/ml)。聚焦電壓:1500V (1 min)+3000V (10 min)。UV 280 nm 檢測；(C) Orbitrap Fusion Lumos采集的曲妥珠單抗的總離子流圖（m/z 1500-4000）。

　　（2）iCIEF-MS分析曲妥珠單抗

　　圖2展示了曲妥珠單抗電荷異構體的iCIEF-MS分析結果。從圖2A可看出共有4個電荷異構體的峰被分離并鑒定，包括一個堿性峰、一個主峰、兩個酸性峰。圖2E的主峰解卷積結果表明，主峰的主糖型(G0F/G0F)的質量為148 058.4 Da，與理論質量148 057.2 Da相差8 ppm。

　　圖2D的堿性峰解卷積結果表明，堿性峰也含同樣含有低豐度單糖基G0F、G1F和G2F，其完整分子量相對主峰差了?19.4 Da，這說明是由Asn (?17 Da)或Asp/isoAsp (?18 Da)形成琥珀酰亞胺。圖2F顯示了酸性峰#1解卷積結果，酸性峰#1的分子量與主峰相差+1.2 Da，酸性峰#2（圖2未展示）的分子量與主峰相差+1.8 Da，這表明它們分別是經過單次脫酰胺修飾和兩次脫酰胺修飾形成。

圖2 iCIEF-MS分析曲妥珠單抗：(A) 曲妥珠單抗TIC-MS，m/ z1500-4000；(B) 主峰質譜圖；(C) 主峰質譜圖局部放大；(D) 堿性峰解卷積結果；(E) 主峰解卷積結果；(F) 酸性峰#1的解卷積譜結果。

　　（3）iCIEF-MS分析fusion mAb

　　圖3展示了分子量190 KDa的融合單抗的iCIEF-UV和iCIEF-MS分析結果。我們能清楚地看到UV和MS圖譜中的各個電荷異構體峰能一一對應。這兩個單抗主峰中含量最豐富的糖基G0F/G0F的分子量測定精度分別為15ppm(圖3A)和18ppm(圖3B)，SD分別為2 ppm(n=3)和3ppm (n=5)。盡管獲得的質量精度較低，但較小的SD值仍能幫助我們可靠地測定主峰與堿性峰和酸性峰的質量差異。圖3A中單抗堿性峰的質量與主峰相比差了?19 Da (SD 2 ppm,n=3)，圖3B中的單抗堿性峰的質量差了?20 Da (SD 3 ppm,n=5)，表明該分子可能已在肽水平上進行了焦谷氨酸修飾(?18 Da)。酸性峰A1、A2、和A3的質量增加了6 Da，最有可能是因于脫酰胺形成的不同電荷異構體。

圖3 融合抗體的iCIEF-UV和iCIEF-MS分析結果

　　參考文獻：略

　　原文請參考：Schlecht J, Moritz B, Kiessig S, Neusü? C. Characterization of therapeutic mAb charge heterogeneity by iCIEF coupled to mass spectrometry (iCIEF–MS). Electrophoresis. 2022；1–9.

　　https://doi.org/10.1002/elps.202200170

　　當然，如果要進行更深度的表征以確定修飾位點和修飾類型，僅僅依靠iCEIF-MS獲得的完整分子量信息還不夠，這時我們可借助CEInfinite的餾分收集功能，對iCIEF分離的電荷異構體餾分收集后進行酶解，再使用HPLC-MSMS進行肽圖表征。

　　我們在下一期的iCIEF的專題中，將為您分享餾分收集功能在電荷異構體表征中的應用。