AccuTOF DART系統(tǒng)的峰形校正和分子式測定
引言 運行在5000或更高分辨率的飛行時間質(zhì)譜(TOF)，通過細(xì)致實驗，及將一個或更多內(nèi)標(biāo)與分析物選擇性或同時引入質(zhì)譜系統(tǒng)的鎖定質(zhì)量噴霧[2]或雙噴霧[3]，能夠獲得5 ppm甚至更高的質(zhì)量精度。DART離子化技術(shù)的發(fā)明，大大簡化了這些內(nèi)標(biāo)的引入，由于可以適用不同類型的樣品，它可以很少或不需要樣品制備過程，實時或現(xiàn)場進(jìn)行質(zhì)量測定[4]。 雖然5 ppm的高質(zhì)量精度對于元素組成檢測是必要的，但這對于未知物分子式識別并不充分，即使是高于ppm級的質(zhì)量精度，也有一些化學(xué)上可能的分子式待選，特別是當(dāng)m/z高于400 Da[5-6]。 幸運的是，有其它重要信息能用于分子式測定。優(yōu)于單同位素峰的單點質(zhì)量測定，對于一個給定離子，整個同位素輪廓，無論是完全分開與否，包含潛在同位素分布的精細(xì)結(jié)構(gòu)信息，而這同元素組成密切相關(guān)。簡單測定同位素峰(M、M+1、…)的相對強度，對于減少可能分子式列表是非常有用的附加工具，特別是化合物含有Br-、Cl-或S-有顯著同位素特征元素時[5]。其它方式包括簡單的計算機建模，以及精心構(gòu)建高斯或其它峰形函數(shù)[7-9]，但是，這些方式僅僅試圖大致接近真正的同位素輪廓圖，因為實際測量得到的峰形是未知或不能使用，導(dǎo)致產(chǎn)生百分之幾的建模誤差，這個級別的誤差大于分子式譜圖之間的細(xì)微差別，大大限制了同位素輪廓信息的使用。TOF MS系統(tǒng)的離子到達(dá)時間分布(峰形)具有特征的較大拖尾，建立足夠準(zhǔn)確的峰形函數(shù)用于分子式區(qū)分變得更為困難(如果可能)。 這篇應(yīng)用文章通過來自AccuTOF DART系統(tǒng)的一個實例，顯示了TOF MS峰形校正對于分子式識別的重要性，說明不使用內(nèi)標(biāo)或外標(biāo)，利用MassWorks sCLIPS(自校正線形譜圖同位素輪廓搜索)對于分子式檢測的可行性。 實驗 名義質(zhì)量數(shù)m/z為319 Da的未知化合物及作為內(nèi)標(biāo)的PEG離子，在AccuTOF DART系統(tǒng)測量，然后將平均化的質(zhì)譜輸出為JCAMP數(shù)據(jù)格式輸入到MassWorks軟件(Version 2.0，2008年4月22日發(fā)布，Cerno Bioscience, Danbury, CT, USA)處理并進(jìn)行分子式測定，離子計數(shù)閾值設(shè)置為零，以便確保采集得到真正的原始輪廓模式MS數(shù)據(jù)。 結(jié)果 圖1(頂圖)顯示了輸入到MassWorks后的完全質(zhì)譜圖，圖1(底圖)顯示名義質(zhì)量為319 Da的感興趣未知離子部分。雖然有PEG離子能用作校正標(biāo)準(zhǔn)，但為了證明MassWorks 2.0新自校正特點(sCLIPS)的有用性，在這個應(yīng)用中決定忽略這個校正離子。 圖2顯示了MassWorks sCLIPS的通常數(shù)據(jù)處理流程。對比低分辨系統(tǒng)如單級四極桿的CLIPS，sCLIPS的關(guān)鍵區(qū)別是使用未知離子本身的單同位素峰進(jìn)行峰形校正，而不校正m/z質(zhì)量軸，這種方式的基本原理基于以下三點： 1. 未知離子的單同位素(校正)峰，在m/z上盡可能地靠近其余的同位素峰 2. 未知離子的單同位素(校正)峰，在測量時間上盡可能靠近其余的同位素峰 3. sCLIPS使用的場合，如較高分辨的MS系統(tǒng)，其單同位素峰與其它同位素如M+1等實現(xiàn)了很好的分離，m/z通常是相當(dāng)準(zhǔn)確的，不需要額外的m/z校正。
圖1. 一個平均的AccuTOF DART MS譜圖(頂圖 -- 完全的MS譜圖;底圖 -- 319 Da未知離子的譜圖部分)
圖2. 高分辨MS系統(tǒng)用于分子式測定的MassWorks sCLIPS通常數(shù)據(jù)處理流程 一旦得到僅包含峰形的校正函數(shù)--有效地將實際峰形函數(shù)轉(zhuǎn)換為理想(已知的、對稱的和可用數(shù)學(xué)表達(dá)的)峰形函數(shù)，這個校正函數(shù)然后被用于到整個同位素輪廓圖，包括其余的同位素峰，得到一個校正的同位素輪廓圖。雖受隨機噪音和其它測量條件(如檢測器飽和)或數(shù)學(xué)誤差影響，但這個校正后的同位素輪廓圖本質(zhì)上應(yīng)該與正確分子式的理論計算譜圖是一樣的，換句話說，作為下面定義的譜圖準(zhǔn)確度應(yīng)該接近100.00%。
這里，e是符合殘余向量，r是校正的同位素輪廓向量，||.||2 代表向量的函數(shù)(或者平方和的方根)。譜圖準(zhǔn)確度指標(biāo)用于評價在一定質(zhì)量誤差范圍內(nèi)，測定的實際單同位素峰質(zhì)量與實際單同位素峰質(zhì)量相近的所有可能分子式的元素組成與給定化學(xué)式的符合程度。具有高譜圖準(zhǔn)確度的分子式是感興趣未知離子的可能正確分子式。
圖3顯示了僅僅單同位素峰(頂圖)和全部同位素輪廓(底圖)經(jīng)過sCLIPS校正前后的峰形對比，校正后的理想峰形明顯地補償了TOF的峰形拖尾，而沒有任何明顯的分辨率損失。應(yīng)該注意的是，在318 Da存在一個可能來自M-H離子的質(zhì)譜干擾，當(dāng)sCLIPS分子式測定時也應(yīng)該考慮。
圖3. 感興趣離子的原始(黑色)和峰形校正后(紅色)質(zhì)譜圖(頂圖 -- 單同位素峰;底圖 -- 包含可能M-H離子的完全同位素輪廓) 表1顯示了sCLIPS分子式測定參數(shù)和結(jié)果，需要注意的是，可能存在的M-H構(gòu)形用于混合搜索，MassWorks 2.0的一個新特點能處理三個相關(guān)的干擾離子，相應(yīng)地，譜圖準(zhǔn)確度工具現(xiàn)在能夠計算相對于319.1043 Da測定質(zhì)量，從-1.5 Da到4.5 Da的質(zhì)量范圍，因此覆蓋了可能干擾離子的全部同位素輪廓。總共70種不同分子式滿足±10 mDa的質(zhì)量偏差(見表1)，正確的分子式C17H20N2SCl ，顯示了97.27%的高譜圖準(zhǔn)確度. 作為MassWorks 2.0的新增特點，用戶可以點擊列表中的每個分子式，將分子式計算得到的理論質(zhì)譜圖與校正后的譜圖進(jìn)行疊加，觀察匹配程度。圖4顯示了校正后質(zhì)譜圖與排名靠前(正確)的理論分子式C17H20N2SCl的譜圖疊加，說明包含來自M-H離子貢獻(xiàn)的全部同位素輪廓的很好譜圖匹配。事實上，軟件額外說明了M和M-H的相對濃度為91%和9%。對比圖3中顯示的原始譜圖與校正譜圖的不同，峰形校正清楚地表明了在得到高譜圖準(zhǔn)確度上起到了關(guān)鍵的作用，這有助于實現(xiàn)的分子式測定，更有意義的是這是不需要內(nèi)標(biāo)或外標(biāo)校正的前提下實現(xiàn)的。 表1. sCLIPS分子式檢測參數(shù)和結(jié)果(僅顯示了70個待選分子式的前16個)
圖4. 譜圖準(zhǔn)確度為97.27%排在位的分子式(C17H20N2SCl)的理論質(zhì)譜圖(綠色)與校正譜圖(紅色)的疊加
圖5顯示了校正后譜圖與排名第二分子式(C15H24O3SCl )的譜圖匹配，該分子式僅有15個碳，譜圖準(zhǔn)確度為96.52%，顯示在320 Da峰上的輕微不同，再一次表說明了用已知峰形函數(shù)對真正同位素輪廓建模的重要性。有趣的是，在表1的可能分子式列表中，排在頂部的待選分子具有氮元素，說明這種疊加質(zhì)譜圖能作為分子式可能元素檢測的有效工具用。
圖5. 譜圖準(zhǔn)確度為96.52%排名第二的分子式(C15H24O3SCl，無氮元素)的理論譜圖(綠色)與校正譜圖(紅色)疊加圖
相似地，圖6顯示了沒有考慮M-H離子干擾時地譜圖疊加，質(zhì)譜窗口為更小的-0.5- 4.5 Da，可以觀察到明顯的譜圖準(zhǔn)確度降低(96.36%，相對于表1或圖4中包含M-H時的97.27%)，這個譜圖匹配的降低也能在320 Da離子匹配圖中清楚地看到。
圖6. 沒有考慮M-H離子的譜圖準(zhǔn)確度為96.36%排名的分子式(C17H20N2SCl)的理論譜圖(綠色)與校正后譜圖(紅色)的疊加
結(jié)論
MassWorks sCLIPS不需要內(nèi)標(biāo)或外標(biāo)校正標(biāo)樣，通過利用未知物本身的同位素離子進(jìn)行關(guān)鍵的峰形校正。峰形校正結(jié)合在AccuTOF DART系統(tǒng)上已經(jīng)得到的高質(zhì)量準(zhǔn)確度，實現(xiàn)了分子式的識別，大大增加了儀器使用的方便性。增加的混合物搜索和交互式譜圖疊加功能，允許用戶查看校正和理論計算譜圖的匹配程度，對于任何存在的質(zhì)譜干擾提供有價值的信息，也可以在分子式測定過程中包含和排出某些元素。
致謝
感謝JEOL USA, Inc的Robert B. Cody博士為本文提供的數(shù)據(jù)及其熱情討論。
參考文獻(xiàn)
[1] Jeol Ltd. Tokyo, Japan
[2] http://www.waters.com/waters/nav.htm?locale=en_US&cid=1000396
[3] Edgar Naegele, Pharma Asia, April 25, 2008, http://www.pharmaasia.com/article-5582-statisticevaluationofmassaccuracymeasurementsbyesitofwithasampleofdegradationproductsfromtheantibiot-Asia.html.
[4] Robert B. Cody et al, Anal. Chem. 2005, 77, 2297-2302.
[5] Kind, T. BMC Bioinformatics 2006, 7, 234.
[6] Don Kuehl, Am. Lab. Online, January 2008, http://americanlaboratory.texterity.com/al-online/200801ol/?pg=18
[7] Evans, J. E.; Jurinski, N. B. Anal. Chem. 1975, 47, 961-963b
[8] Tenhosaari, A. Org. Mass Spectrom. 1988, 23, 236-239.
[9] Do Lago, C. L.; Kascheres, C. Comput. Chem. 1991, 15, 149-155.
[10] Yongdong Wang, US Patent 6,983,213, filed October 20, 2003.
[11] Yongdong Wang, Cerno Application Note Number 103, December 2006, http://www.cernobioscience.com/resources/ApplicationNotes/Agilent_LC-MS_Single_Quad_Infusion.pdf
關(guān)于綠綿科技
北京綠綿科技有限公司(簡稱：綠綿科技)以體現(xiàn)客戶服務(wù)價值為宗旨，以專業(yè)精神和技能為廣大實驗室分析工作者提供樣品前處理、樣品制備及分析、實驗數(shù)據(jù)精確分析和管理的全面解決方案，致力于協(xié)助客戶提高分析檢測的效率和水平。主要代理產(chǎn)品聯(lián)系電話：010-82676061/2/3/4/5/6/7/8
E-mail：info@lumtech.com.cn。
